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Tecnología de las Biotransformaciones
 
 
 
Diseño de sistemas catalíticos activos basados en enzimas libres/soportadas para aplicaciones eco-compatibles en la industria farmacéutica.

Diseño de sistemas catalíticos activos basados en enzimas libres/soportadas para aplicaciones eco-compatibles en la industria farmacéutica.

 

Responsable: Dra. Laura Briand

 

Personal

Dra Silvana R. Matkovic

Bioquímica Carla José

Dra. Rita D. Bonetto

Dr. Luis A. Gambaro

Sra. Graciela Valle

 

Personal No CINDECA

Dra. María Luján Ferreira (Plapiqui, Bahía Blanca)

Dra. María Laura Foresti (Facultad de Ingeniería, Univ. Nac. de Buenos Aires)

Dr. Sebastián E. Collins (Intec, Santa Fé)

Dr. Adrián Bonivardi (Intec, Santa Fé)

Dra. Susana Morcelle del Valle (Liprove, Univ. Nac. de La Plata)

Lic. Carlos Llerena Suster (Liprove, Univ. Nac. de La Plata)

 

Red Científico-tecnológica: la Dra. Laura E. Briand (Nodo 1, La Plata), Dra. Ma. Luján Ferreira (Nodo 2, Bahía Blanca) y el Dr. Sebastián Collins (Nodo 3, Santa Fé) mantienen una red científica en el marco del PICT Redes 729/06 subsidiado por la ANPCyT.

 

 

Descripción, Objetivos y Grado de Avance

 

El objetivo de esta línea de investigación es la búsqueda de correlaciones fundamentales entre estructura molecular superficial y actividad catalítica de biocatalizadores en la resolución enantioselectiva de ácidos carboxílicos con actividad farmacológica tales como: ibuprofeno, ketoprofeno, naproxeno y flurbiprofeno. Este objetivo involucra la caracterización de lipasas comerciales y en especial el biocatalizador Novozym® 435 de la empresa Novozymes, como así también la investigación de biocatalizadores propios a base de lipasas inmovilizadas sobre soportes orgánicos e inorgánicos.

 

a) Esterificación Biocatalítica de Ácidos Carboxílicos Racémicos para la Obtención de Enantiómeros con Actividad Farmacológica

 

El avance en el conocimiento de los mecanismos de acción de los fármacos a nivel molecular ha permitido descubrir la importancia que tiene la estereoquímica de estas sustancias en su eficacia terapéutica. En muchos casos, sólo uno de de los enantiómeros de estas sustancias es farmacológicamente activo, mientras que el otro puede ser inactivo o tóxico. En este contexto, los derivados del ácido 2-aril propiónico como el ibuprofeno, naproxeno y ketoprofeno son mezclas racémicas que pertenecen a la familia de los antiinflamatorios no-esteroides o AINES cuya actividad farmacológica reside en el isómero S(+). Las ingestas recurrentes de las mezclas racémicas de los ácidos 2-aril propiónicos es típica de los pacientes con dolores crónicos causados por inflamaciones. En estos casos, se han reportado efectos colaterales como hemorragias y úlceras gastrointestinales, nefrotoxicidad, bronco espasmo, erupción cutánea y alergias. Estas observaciones dieron origen a un mercado mundial ávido por enantiómeros simples de fármacos quirales desde 1994. A su vez, esta demanda impulsó investigaciones académicas y de compañías farmacéuticas para desarrollar metodologías de producción de enantiómeros simples ya que estas formulaciones permitirían la administración de la mitad de la dosis de los fármacos con lo cual, se lograría disminuir la incidencia de los efectos indeseables nombrados antes.

En este contexto, se investigó la esterificación de ibuprofeno racémico por vía enzimática llevada a cabo en un medio compuesto sólo por la mezcla de ibuprofeno y un exceso de alcohol. Los estudios de resolución racémica biocatalítica de ibuprofeno demostraron la factibilidad de llevar a cabo la esterificación de ibuprofeno utilizando un biocatalizador comercial conocido como Novozym® 435 (M. L. Foresti, M. Galle, M. L. Ferreira, L. E. Briand, J. Chem. Tech. Biotechnol. 84 (2009) 1461-1473). En este contexto, el ensayo de diferentes alcoholes de esterificación y de diversos contenidos acuosos iniciales revelaron que la esterificación con etanol en un medio con 4.8 % de agua, resulta la mejor de las opciones ensayadas en términos de éster total producido y exceso enantiomérico. Una vez optimizada la reacción en estudio se llevó a cabo el estudio cinético de la misma en las condiciones óptimas halladas, durante un tiempo de 72 horas. Se llegó a obtener un 62 % de conversión del ibuprofeno con un exceso enantiomérico de 54 % hacia el isómero S(+)-Ibuprofeno en 72 hs de reacción, sin embargo a las 48 horas se llega a una meseta en cuanto a conversión y exceso enantiomérico. En base a los resultados obtenidos hasta el momento se evaluó el reuso del biocatalizador sometiendo el mismo a ciclos de reacción de 48 horas en condiciones óptimas, evaluando en cada ciclo la conversión y el exceso enantiomérico. Este estudio demostró la posible aplicación de Novozym®435, en la reacción considerada, durante 3 ciclos consecutivos de 48 horas sin pérdidas de actividad ni enantioselectividad, sin embargo se observó una disminución en dichos parámetros de reacción a partir del cuarto ciclo. Esto motivó la búsqueda de las causas que llevan a tal desactivación.

En este contexto, se estudió la interacción de etanol con el biocatalizador mediante la adsorción del alcohol a 32 ºC (alcohol en fase gas) seguida de Reacción Superficial a Temperatura Programada in situ (TPSR). Esta investigación demostró que se requiere una temperatura superior a 52 ºC para la desorción del alcohol debido a la fuerte adsorción del etanol con Novozym® 435 (Deactivation of Novozym® 435 during the Esterification of Ibuprofen with Ethanol: Evidences of the Detrimental Effect of the Alcohol. Carla José and Laura E. Briand, Reac. Kinetics, Mechanism Catal. 99(1) (2010) 17-22). Así mismo, la adsorción de ibuprofeno sobre el catalizador se estudió mediante isotermas de adsorción a  25 ºC, 28 ºC y 32 ºC durante 40 minutos. El análisis de enantiómeros de ibuprofeno a distintos tiempos a cada temperatura se realizó con una columna HPLC quiral, en la cual se evidencia la ausencia de reacción por ausencia de señales de esteres de etilo en el cromatograma. Los resultados demostraron que a 32 ºC cae abruptamente la adsorción de ibuprofeno, siendo una posible causa la fuerte interacción del alcohol a tal temperatura.

Posteriormente se llevaron a cabo tratamientos sucesivos de Novozym®435 con etanol y etanol/agua (4.8 % v/v) a 28 ºC durante 40 minutos y a 45 ºC durante 48 hs. Los líquidos de cada ciclo se evaporaron, los sólidos resultantes de tal evaporación como también el bioctatalizador post tratamiento fueron estudiados por FTIR. Esto demostró una disolución del catalizador con pasaje de soporte y de proteína al líquido y un cambio en la estructura secundaria de la proteína soportada en respuesta al contacto con etanol. El biocatalizador sometido a estos tratamientos con alcohol fue estudiado también por TPSR encontrándose que el alcohol se adsorbe fuertemente sobre Novozym®435 requiriéndose de temperaturas entre los 150 ºC y 200 ºC para su desorción. Finalmente se estudió el efecto del etanol sobre Novozym®435 analizando el biocatalizador sin uso y luego de los sucesivos tratamientos con alcohol mediante microscopía electrónica medioambiental ESEM. Las imágenes obtenidas demuestran deterioro de la superficie externa del catalizador y, en cuanto a la estructura interna, aumento de la estructura porosa del material.

Se demostró que los sucesivos ciclos de tratamiento con etanol provocan la desorción de la enzima Candida antarctica B del biocatalizador Novozym®435. Inicialmente, se ensayó la cuantificación de la enzima en el medio orgánico por el método del ácido bicinconínico. Sin embargo, esta metodología no resultó exitosa ya que fue imposible obtener datos reproducibles y confiables. Por esta razón, se desarrolló la metodología de cuantificación de proteina por espectroscopía UV-Vis a partir de soluciones de la enzima CALB en etanol. En este contexto, se aplicó la metodología de cuantificación de precipitación total de proteinas en la solución de enzima CALB de referencia.

Los resultados de las investigaciones detalladas más arriba se volcaron el el artículo denominado: Investigation of the Causes of Deactivation-Degradation of the Commercial Biocatalyst Novozym® 435 in Ethanol and Ethanol-Aqueous Media” por Carla José, Rita D. Bonetto, Luis A. Gambaro, María del Pilar Guauque Torres, María Laura Foresti, María Luján Ferreira, Laura E. Briand; que se encuentraba en prensa en el Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic en el año 2010.

            Asimismo, los resultados se presentaron en dos congresos internacionales y uno nacional:

 

a.1) Evidencias del efecto perjudicial del etanol en el biocatalizador comercial Novozym® 435. Carla José, L. A. Gambaro, G. M. Valle, R. D. Bonetto, K. Won Kang, L. E. Briand. Acta del IV Encuentro Regional de Biocatálisis y Biotransformaciones (EnReBB 2010), Montevideo, Uruguay, 8-10 de Diciembre de 2010. Sección Ingeniería de Biocatalizadores PIB-6, pág. 70.

 

a.2) Desactivación de Novozym® 435 durante la Esterificación de Ibuprofeno con Etanol: evidencias del efecto perjudicial del alcohol. C. José, L. A. Gambaro, G. M. Valle y L. E. Briand. Acta del XXII CICAT - Congreso Iberoamericano de Catálisis. Viña del Mar, Chile, 5-10 de Septiembre de 2010. Sección B-O-3, página 19.

 

a.3) Ciencia de los Materiales Aplicada a la Biocatálisis: Investigación de la Estabilidad de un Biomaterial Catalítico. Carla. José. Coordinador: Laura E. Briand. Acta de las XVIII Jornadas de Jóvenes Investigadores, Santa fé, Argentina, 19 al 21 de Octubre de 2010. Sección Ciencia e Ingeniería de Materiales, 02.CIM.04, página 16.

b) Síntesis y Caracterización Molecular de Bio-catalizadores a Base de Enzimas Inmovilizadas

 

El estudio de la estructura secundaria de los sistemas enzima-soporte permite obtener correlaciones fundamentales entre estructura y actividad bio-catalítica. El grupo de investigación publicó la metodología para establecer la estructura secundaria de las enzimas inmovilizadas (contenido de a-hélices, cordones, láminas-b y agregados intermoleculares) por espectroscopía infrarroja de transmisión y el análisis de los espectros a través de un software de deconvolución de señales a los fines de establecer la contribución de las conformaciones nombradas anteriormente en la estructura secundaria en la enzima.

Así mismo, se han sintetizado nuevos materiales bio-catalíticos a través de la adsorción simple de la lipasa de Candida antarctica B y fito-proteasas sobre TiO2 (M. L. Foresti, G. Valle, R. Bonetto, M. L. Ferreira, L. E. Briand. FTIR, SEM and Fractal Dimension Characterization of lipase B from Candida antactica B onto Titania at Selected Conditions, Appl. Surf. Science 256 (2010) 1624-1635).

Estas investigaciones permitieron desarrollar metodologías para la cuantificación del contenido enzimático en medio acuoso y orgánico por espectroscopia UV-Vis, el análisis conformacional de las proteínas (como se comentó anteriormente), el estudio de la estructura terciaria de las enzimas por microscopía electrónica de barrido y la evaluación de la textura superficial a través de la determinación de la dimensión fractal (Cuantificación de Proteínas en Etanol por Espectroscopía UV-Vis. Carla José. Laura. E. Briand. Acta del XXVIII Congreso Argentino de Química, Área Química Industrial, Lanús, Buenos Aires, Argentina, del 13 al 16 de Septiembre de 2010. (www.aqa2010.org.ar/site/trabajos.php).

 

Adicionalmente, se prepararon y caracterizaron biocatalizadores a base de la lipasa de Candida antarctica B (CALB) con quitosano como soporte, utilizando como métodos de inmovilización la adsorción simple y el acoplamiento covalente mediante el uso de glutaraldehído y poliglutaraldehído. Se estudió a los biocatalizadores preparados mediante DRIFTS, SEM/EDAX y un estudio de estabilidad térmica en forma comparativa a la lipasa libre. También se caracterizaron por XRD y TEM/EDAX sistemas polímero-magnetita con celulosa y quitosano como matriz, utilizándolos como soporte de la lipasa de Rhizomucor meihei. Estos catalizadores, a diferencia del biocatalizador comercial, no desorben la enzima en contacto con etanol (cuatro ciclos de tratamiento con etanol durante 48 hs en cada caso, a 45 ºC y 200 rpm) lo cual resulta un descubrimiento relevante porque permitiría su reuso en sucesivos ciclos de reacción. En este sentido, se evaluará su actividad y enantioselectividad en la esterificación de ibuprofeno con etanol

 

Asimismo, se investigó el efecto de medios con altas proporciones (90 y 99%) de solventes orgánicos miscibles, acetonitrilo y metanol sobre la estabilidad de la actividad proteolítica de un extracto crudo de papaína a través de distintas técnicas espectroscópicas a fin de explicar los comportamientos observados. Dada la complejidad del extracto de papaína, se procedió a estudiar el efecto de dichos solventes sobre la estructura de la papaína pura por fluorescencia intrínseca y fluorescencia empleando ANS como sonda fluorescente, así como por espectroscopia FTIR. No se pudo establecer una correlación directa entre la estabilidad de la actividad proteolítica del extracto crudo con los cambios observados en la estructura de la papaína pura. El ACN no afectó la actividad del extracto crudo de papaína pero sí alteró severamente y de forma irreversible la conformación de la papaína pura. Este hecho indicaría el rol protector del resto de los componentes del extracto crudo sobre la actividad enzimática. Por su parte, el metanol provocó una disminución de la actividad del extracto crudo, y afectó la conformación de la papaína pura, especialmente su estructura secundaria. Sin embargo, fue detectado cierto grado de reversibilidad conformacional, lo que explicaría la actividad residual obtenida. Los resultados se presentaron en los siguientes congresos internacionales:

 

b.1) Estabilidad de papaína en solventes miscibles con bajo contenido acuoso. Carlos R. Llerena-Suster, Franco Bernabei, Erika Bartel, Graciela M. Valle, Laura E. Briand, Susana R. Morcelle. Actas del XXII Congreso Iberoamericano de Catálisis. Sección B-P-15, página 114.

 

b.2) Estudio y Selección de Medios Óptimos para el Uso de Papaína como Biocatalizador. Carlos R. Llerena-Suster, Carla José, Sebastián E. Collins, Laura E. Briand, Susana R. Morcelle. Acta del IV Encuentro Regional de Biocatálisis y Biotransformaciones (EnReBB 2010), Montevideo, Uruguay, 8-10 de Diciembre de 2010. Sección Screening y Caracterización de Nuevos Biocatalizadores PSB-8, página 81.

 
 
 
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